Investigación
VISIÓN DEL AUTOR
Papel de la formina FMNL1β en la secreción polarizada de células T en la sinapsis inmunitaria
Javier Ruiz Navarro
Laboratorio de Nanoinmunología y Linfocitos T.
Instituto de Investigaciones Biomédicas Sols-Morreale (IIBM; CSIC) Madrid.
RESUMEN
En este trabajo, realizado por Javier Ruiz Navarro en el seno del grupo liderado por Manuel Izquierdo Pastor en el Instituto de Investigaciones Biomédicas Sols-Morreale (IIBM; CSIC-UAM) se ha estudiado cómo una proteína de la familia de las forminas, FMNL1β (formin-like 1 beta, por sus siglas en inglés), influye en la activación mediada por antígeno de las células T en el contexto de la sinapsis inmunitaria y en la secreción especializada que se produce en la misma. Para ello, los autores han usado el sistema de línea celular T CD4+ Jurkat, cuyo receptor de antígeno (TCR) reconoce el super-antígeno bacteriano E, de Staphilococcus aureus (SEE), presentado en el contexto del complejo mayor de histocompatibilidad (HLA-DR). En este estudio se ha usado la línea celular B Raji como célula presentadora de antígeno profesional para establecer sinapsis inmunitarias. Los autores también han utilizado linfocitos primarios humanos aislados de sangre circulante de donantes sanos para formar sinapsis con las células Raji. Además, han colaborado con el grupo de investigación traslacional en oncología pediátrica del IdiPAZ y el CNIO (liderado por Dr. Antonio Pérez-Martínez), para estudiar el papel de FMNL1β en sinapsis formadas por linfocitos T primarios que expresan un receptor de antígeno quimérico (CAR-T) dual. Dicho CAR está dirigido contra las moléculas CD19 y CD22 de linfocitos B, por lo que reconoce a las células Raji (CD19+/CD22+). Por ello, el papel de FMNL1β se ha extendido, aparte del modelo celular Jurkat, a contactos sinápticos establecidos por linfocitos T primarios a través del TCR, y de células CAR-T utilizadas en la terapia de leucemia linfoblástica aguda B, poniendo de manifiesto su posible papel como regulador de estos procesos.
Se conoce que la activación del linfocito T a través de la formación de la sinapsis por el reconocimiento antigénico por parte del TCR desencadena distintas rutas de señalización (Figura 1); algunas de ellas implican a distintas isoformas de proteína quinasa C (PKC), que regulan tanto la dinámica del citoesqueleto de actina como el de tubulina. En concreto, se ha analizado el papel de estas quinasas en la traslocación del centrosoma a la sinapsis. Este paso facilita la secreción polarizada de exosomas, a través de la localización de los cuerpos multivesiculares (MVB), en los que se forman los exosomas. Los exosomas son nanovesículas relevantes para la comunicación entre las células T y las células presentadoras de antígeno que se liberan al espacio intercelular y son captados por las células presentadoras. Para la secreción polarizada en la zona de contacto sináptico se requiere que los filamentos de actina se despolimericen en el denominado dominio secretor, localizado en la zona central de la sinapsis del linfocito T, donde se acumulan los TCRs.
Los autores han demostrado que la relocalización de FMNL1 en la sinapsis tras la activación del TCR es necesaria para la posterior polarización del centrosoma y los MVB mediante el silenciamiento específico de la proteína en linfocitos T. Para ello, han interferido la expresión de todas sus isoformas, FMNL1a, FMNL1b y FMNL1g. Para identificar la isoforma concreta que es responsable de este efecto en la célula T, se han realizado experimentos de rescate mediante la expresión de FMNL1β, de modo que se restauró el fenotipo de polarización del centrosoma y los MVBs hacia la sinapsis. La relevancia de la fosforilación de la proteína se demostró mediante la sobre-expresión de proteínas con mutaciones puntuales en el residuo S1086. Cuando se expresó en las células un mutante de FMNL1b que no podía ser fosforilado (FMNL1βS1086A) no se producía la polarización del centrosoma y los MVB. Sin embargo, al expresar un mutante fosfomimético (FMNL1βS1086D) se recuperó la capacidad de las células de formar sinapsis normales, lo que incluye, además de la polarización del centrosoma y los MVB, la disminución de la actina filamentosa en la zona de secreción en la sinapsis, lo que facilita que se produzca adecuadamente la secreción polarizada del contenido de los MVBs.
Para determinar el posible papel de la isoforma novel PKCδ en la fosforilación de la proteína se utilizó un clon de Jurkat interferido para la expresión de la kinasa. En dicho clon, el mutante fosfomimético no rescató la deficiencia en la polarización del centrosoma, por lo que la fosforilación de FMNL1β en el residuo S1086 se requiere, pero no es suficiente para que se produzca la polarización del centrosoma, aunque FMNL1βS1086D sí se localiza en la sinapsis.
El uso de videomicroscopía de célula viva ha permitido estudiar la formación de la sinapsis inmunitaria con detalle. Por otra parte, los autores han implementado en su sistema el uso de microscopía de súper-resolución STED, con lo que han podido determinar con mayor resolución la localización de los exosomas de interés en la interfase sináptica entre la célula T y la presentadora, visualizando la secreción polarizada. Por otra parte, el uso tanto de linfocitos T primarios como de linfocitos CAR-T para estudiar la sinapsis ha facilitado la compresión del papel de FMNL1β en la regulación de la capacidad secretora de las células T. Estos descubrimientos pueden tener gran relevancia para diseñar inmunoterapias combinadas y aumentar la capacidad lítica de los CAR-T.
Resumen Gráfico
Cita
Ruiz-Navarro J, Fernández-Hermira S, Sanz-Fernández I, Barbeito P, Navarro-Zapata A, Pérez-Martínez A, Garcia-Gonzalo FR, Calvo V, Izquierdo-Pastor M. Formin-like 1β phosphorylation at S1086 is necessary for secretory polarized traffic of exosomes at the immune synapse in Jurkat T lymphocytes. eLife. 2024,13:RP96942. https://doi.org/10.7554/eLife.96942.4
Entrevista con el autor
Parte 1. Curioseando dentro del estudio
¿El experimento que más te ha gustado?
Sería un compendio de experimentos. Destacaría los experimentos de inmunoprecipitación y aquellos en los que analizamos cómo la fosforilación de FMNL1β afecta a la remodelación de la actina cortical en la sinapsis inmunitaria, ya que los considero especialmente relevantes. Sin embargo, si tuviera que elegir, me quedaría con aquellos que han tenido que ver con aprender a hacer microscopía de súper-resolución con STED, en la que me he entrenado mucho.
Aplicar estos métodos a nuestro sistema nos ha permitido mejorar mucho los coeficientes de colocalización respecto al confocal clásico, pudiendo bajar en algunos casos a 50 nm de resolución en XY. Hemos intentado también hacer STED en 3D, y hemos obtenido imágenes muy interesantes. Estamos con ello para conseguir estudiar mejor la estructura de la sinapsis inmunitaria; es todo un desafío.
Siempre en células fijadas:
Sí, la verdad es que sí. En célula viva las condiciones experimentales son otras. Es más complejo, pero quiero intentarlo, y sería lo siguiente. Hay que buscar financiación para algunos elementos tecnológicos. Necesito conseguir un stage para hacer in vivo. La verdad es que me encantaría.
El trabajo se ha realizado fundamentalmente en línea celular Jurkat. ¿Las primarias?
Una buena parte de los resultados se realizaron con la línea celular Jurkat, que es un modelo reconocido para estudiar la sinapsis inmunitaria y la activación del linfocito T.
Sin embargo, también hemos incluido algún experimento con linfocitos T primarios y con el CAR dual CD19/CD22 dirigido contra la célula B, que se está desarrollando en el IdiPAZ. En ambos, casos, al igual que en el modelo Jurkat, observamos que FMNL1 se acumula en la zona de la sinapsis de la célula T.
Un siguiente paso en futuros trabajos será seguir explorando y validando estos resultados en este tipo de modelos. FMNL1 está en la interfase entre el citoesqueleto de actina y el de tubulina; regula como otras forminas la relación entre los dos citoesqueletos.
¿Se ha visto algún tipo de mutación en humanos que haga de especial interés su estudio en el ámbito de la función del sistema inmunitario?
Sí, se han identificado variantes de FMNL1 que parecen involucradas en procesos tumorales, a través de la regulación de la migración celular en procesos cómo la metástasis. Aunque en nuestro laboratorio aún no abordamos directamente este aspecto, nos resulta muy interesante desde la perspectiva terapéutica.
En el contexto de las células CAR-T, por ejemplo, estudiar cómo estas variantes influyen en la secreción y migración podría abrir la posibilidad de optimizar su eficacia. Con ello, se podría incluso plantear la edición genética en el diseño del CAR para potenciar la respuesta antitumoral. De hecho, algunos datos publicados respaldan la relevancia de FMNL1 y otras forminas, como mDia1, en la regulación de estos procesos, lo que hace de este gen un candidato prometedor para futuras investigaciones en inmunoterapia.
¿Qué experimento se te ha quedado en el tintero?
Tengo varios. Desde que acabamos la primera versión del trabajo teníamos claro que había cosas por hacer. Después, los revisores nos lo confirmaron. El hecho de confirmar la translocación de FMNL1 a la sinapsis y ver que no era dependiente del residuo de serina 1086, nos resultó muy interesante. Pero la cinética que se estudió podía ser mucho más completa, y me gustaría explorar esto. Por eso, el STED in vivo podría ser muy interesante; es todo un desafío al que quiero enfrentarme. Y nos serviría mucho para estudiar la localización subcelular precisa de FMNL1β y las co-localizaciones con otras proteínas. Por eso, queremos estudiar también la estructura de los citoesqueletos en la sinapsis con más detalle. Hay muchas cuestiones pendientes todavía y eso es bueno, ya que nos permite seguir avanzando.
¿Y la bioquímica?
Pues está claro que es muy relevante, y además da mucha información. Poder estudiar la conformación de complejos y revelar la dinámica de las interacciones es importante.
También es cierto que la microscopía me gusta mucho, y son técnicas complementarias. Poder obtener resultados combinados es fundamental, ya que nos permite validar y demostrar nuestras hipótesis teniendo una visión más completa de aquello que estudiamos.
¿Cómo ha sido el proceso desde el trabajo de laboratorio hasta la publicación?
La verdad es que todo el proceso de redacción del artículo ha sido muy ilusionante. Al agrupar y ordenar todos los experimentos he ido viendo cómo toma forma el estudio y se asentaba la idea inicial en que se basaba la investigación. Unir puntos entre sí y poder explicarlo.
Es muy importante el proceso de revisión, cuando se lo leen otros expertos y puedes comprobar cómo algo que te parecía que estaba muy acabado, cambia y mejora. En nuestro caso, desde luego, la primera versión era sólida y tenía mucho sentido, pero después del proceso de revisión, la adición de experimentos complementarios ha hecho que todo haya quedado más cohesionado.
Parte 2. Impacto científico y Recorrido por el doctorado
El estudio está publicado en eLIFE, que es una revista muy reconocida internacionalmente. Han cambiado su proceso editorial, que ahora es mucho más dinámico. ¿Crees que el comité editorial es muy estricto con los estudios que mandan a revisores?
Yo creo que sí, llevan poco tiempo con esta nueva política y no sé exactamente cuántos aceptan o rechazan, pero hay muchos artículos que no pasan de la revisión editorial. Inicialmente, el trabajo se presenta del mismo modo que en otras revistas o editoriales. Una vez revisado por el comité editorial, hay muchos artículos que no avanzan a la revisión por pares, como sucede con el resto de revistas. Si lo aceptan, envían el trabajo a revisores y, a partir de dicho momento, el trabajo está on-line, como un pre-print. Esto es distinto a otras editoriales.
Una vez que recibes la crítica de los revisores externos, puedes corregirlo de manera iterativa. Todo está accesible para el público y tú lo vas modificando, tanto si decides rectificarlo, como si no; aparecen distintas versiones cada vez que introduces cambios y nuevos datos. Aunque esté todo on-line, el artículo aún no se considere finalizado hasta que se integra todo el feedback y se alcanza la versión definitiva. Tienes libertad para declararla cuando consideres, y sigue permaneciendo de forma pública todo el proceso que se ha realizado.
Puede que a partir del año 2025 eLIFE no tenga un factor de impacto calculado, tal como anunció Clarivate. ¿Qué piensas sobre esto?
Aquellas publicaciones de eLife que, como la nuestra, han sido consideradas por los editores en su assessment como “important and compelling” van a ser, en principio, indexadas en Clarivate. En principio, en 2024 sí tendrá. En cuanto al factor de impacto, si se tiene sólo en cuenta el DORA para evaluar un CV, esto no tendría mucha importancia. Sin embargo, muchas agencias financiadoras extranjeras (China) sí tienen en cuenta las métricas de Clarivate, para las evaluaciones de los investigadores.
En Nature han sacado una editorial comentando todo el proceso, porque ha levantado bastante revuelo la decisión de Clarivate de no calcular FI para eLIFE, por el hecho de que la revista no tenga todo su contenido indexado.
La editorial nos avisó con tiempo, mientras estábamos en el proceso de revisión del artículo. Fueron muy transparentes, aunque ya teníamos conocimiento de que iba a haber cambios. Nos comentaron que estaba habiendo decisiones diversas por parte de los autores; algunos habían retirado los artículos. Nosotros decidimos seguir.
Entiendo que haya investigadores que hayan decidido probar en otra revista. eLIFE dice que la región del mundo donde han notado más el descenso en el envío de trabajos ha sido en Asia; fundamentalmente en China. Mientras que en otras regiones apenas ha habido impacto. Y supongo que esto tendrá que ver con el tipo de evaluación al que estén sometidos los investigadores en cada región o país. Si las métricas de Clarivate son fundamentales, es normal que los investigadores tengan ese tipo de prevención.
¿Cómo piensas que impactará este artículo en tu carrera investigadora?
Yo creo que será muy beneficioso para mí. Es un trabajo muy completo y que va a impactar positivamente en el campo de la investigación.
La capacidad de los linfocitos T de organizarse de forma intracelular en repuesta a antígenos específicos es un tema que me gusta, y me gustaría seguir en ello. La sinapsis inmunitaria, además, está cobrando más importancia, aunque siempre la ha tenido, pero las técnicas avanzan y la forma de estudiarla, a nivel estructural, por ejemplo, está permitiendo obtener mucha información. Además, la relación con las forminas, como FMNL1, le da un enfoque más concreto.
¿Es suficiente para defender una tesis?
En el programa de doctorado en el que estoy matriculado no me piden un número específico de artículos para poder leer la tesis. Pero a nivel de contenido a mí me gustaría seguir ahondando en este tema y poder tener más datos.
¿En qué año estás de doctorado?
Estoy ya en mi tercer año. Realmente me parece que hace poco que empecé, pero bueno, la verdad es que ha sido un periodo productivo y espero que lo siga siendo. Este es mi primer artículo de datos como primer autor y la verdad es que me ha gustado mucho trabajar en el tema.
Quieres seguir en la investigación académica.
Sí, a mí me gustaría seguir. Sé que es complicado, que aún me queda recorrido, tanto durante el doctorado, como después. No es algo que tenga totalmente decidido, a veces también dudo, pero los desafíos que presenta la investigación me incentivan mucho. Sé que hay que hacer sacrificios, pero me parece que vale la pena.
¿Qué paso es imprescindible para esto?
Me gustaría conseguir una beca propia dedicada al doctorado para terminar el trabajo que estoy haciendo. En este sentido, este artículo creo que me ayudará. Hay que intentarlo. Además, me parecen muy buenas las becas que te permiten seguir un año después de leer la tesis como post-doc en tu laboratorio de formación, mientras buscas el siguiente, y la financiación necesaria. Estaría bien también hacer una estancia para poder completar algunos datos de experimentos. Sería algo interesante como parte de mi formación predoctoral.
La familia qué dice de tu vocación
Bueno, a pesar de la distancia, ya que mi familia vive en Elche, están muy contentos y comparten mi ilusión por lo que hago. Por supuesto, siempre te gusta la cercanía, pero tengo mucho apoyo de ellos. Creo que el tipo de estudios que estoy haciendo les gusta. Llevan con mucho ánimo las diferentes situaciones de la profesión; todos sabemos que hay épocas muy demandantes. Me escuchan bastante y me apoyan. Y por esto, les estoy muy agradecido por ello.
Volumen 44 | Núm. 1
