¿Cuál era la principal pregunta que queríais responder con este estudio?

Habíamos estado trabajando mucho en inmunodeficiencias por defectos en el TCR, que siempre se han estudiado como enfermedades con un patrón de herencia autosómico recesivo.

Estudiábamos el impacto de mutaciones en CD247 presentes en pacientes, como Q101X, Q70X y -en bases de datos- Q142X. Todas afectaban a los ITAMs, y queríamos saber si tenían relación con la expresión en membrana del complejo TCR. Probando mutaciones somáticas para saber si había una selección específica, vimos que con la mutación Q70X la expresión del TCR bajaba en líneas celulares, lo que nos dio la idea de un posible efecto dominante negativo de este tipo de mutaciones en portadores. Para esto usamos la tecnología CRISPR/Cas9, que es realmente una herramienta muy potente. Al presentar estos resultados en un Congreso Europeo de Inmunodeficiencias en Lisboa, una médica de Filadelfia nos comentó que tenían un paciente de poca edad con una mutación en heterocigosis e inmunodeficiencia que no entendían y que podía tener que ver con este proceso. Esto aceleró el proceso a través de una colaboración con ellos.

¿La idea primigenia era entonces…?

La idea inicial era estudiar las reversiones somáticas, posibles en casos de mutaciones puntuales y que surgen de manera excepcional en pacientes con Inmunodeficiencias Combinadas Graves (SCID). Este fenómeno genera pequeñas poblaciones de células con el defecto heredado atenuado. En el caso del gen CD247, la mayoría de los pacientes presentan este tipo de células con reversiones, por lo que la idea original era usar estos modelos para dilucidar si estas mutaciones tienen un mecanismo para seleccionarse y cumplir una función, o si simplemente sucedía de forma azarosa (“random”).

Todo el trabajo que hemos publicado en este artículo proviene del trabajo para estos estudios, y de observaciones que hicimos en el proceso de puesta a punto de nuestros modelos experimentales. Realmente, sigue habiendo preguntas por responder.

¿Y en la práctica, como se aborda este problema?

Con un solo paciente era difícil hacerlo, pero cuando nos estábamos planteando la estrategia, en el Hospital Gregorio Marañón tuvieron unos pacientes que presentaban clínica y detectaron mutaciones similares a las de nuestro estudio en estos casos; había pacientes de dos familias diferentes. La colaboración con las Dras. Elena Seoane y Paloma Sánchez Mateos nos dio la oportunidad de estudiarlos, ya que estaban íntimamente relacionados con el nuestro. Los síntomas de estos pacientes variaban desde la inmunodeficiencia a la autoinmunidad, y esto nos daba idea de que la adaptación y la edad podían ser claves para el desarrollo de la enfermedad, aún estando presentes las mismas mutaciones en CD247 entre familiares, y a pesar de que eran distintas entre las familias; la Y152X y la Q101X, que estaba bien representadas en nuestras líneas.

¿Los plazos fueron sencillos?

Pues por un lado tuvimos la suerte de poder estudiar estos casos nuevos, y por otro lado, cuando quedaba una semana para acabar mi contrato en la UCM tuvimos acceso a muestras de dos pacientes con la misma mutación que el paciente de Filadelfia, aunque tenían mayor edad y distintos síntomas.

Esto hizo que hubiese que hacer todos los experimentos en un tiempo muy reducido. Al tener los métodos y los protocolos muy puestos a punto, pudimos hacerlo. Para ello también conté con el apoyo de compañeras del laboratorio que fueron fundamentales para poder publicar el estudio, como Paula Cárdenas y Rebeca Fernández Megino. En este sentido, me he sentido arropado.

¿Con qué ITAM nos quedamos?

El más importante es el tercero; el más distal. A nivel de expresión en membrana se ve un efecto escalonado, directamente proporcional a la longitud de la cadena resultante, pero a nivel funcional la inducción de la expresión de CD69 se reduce por igual ya falte solo el tercero o todos los dominios ITAM. Aquí hay que recalcar que en pacientes las diferencias son mucho más leves que las observadas con nuestro sistema in vitro de caracterización. La mutación Y152X discrimina muy bien en el caso del efecto extracelular. Hay que decir que la penetrancia no es completa en estos pacientes, lo que hace que se observen efectos sutiles respecto a lo que sucedería en el caso de una deficiencia completa de la proteína. Hay trabajos muy interesantes en que se han estudiado mutaciones y deleciones en ratón para cada uno de los ITAMs y que son muy reveladores; algunos particularmente exhaustivos (Bovolenta, 2022). Nosotros, con nuestro sistema in vitro, hemos realizado una aproximación muy válida que permite estudiar los efectos de una manera relativamente sencilla, cercana al paciente.

¿Qué representa el estudio para el campo?

Realmente, abrimos nuevos caminos y por supuesto quedan preguntas por responder. Hemos demostrado de forma inequívoca que hay mutaciones en CD247 que estando en heterocigosis afectan a la expresión de la proteína y que pueden dar lugar a inmunodeficiencias; dichas inmunodeficiencias pueden convertirse con la edad en enfermedades autoinmunes. Este conocimiento ayudará a la hora de la búsqueda de mutaciones por NGS en pacientes, ya que, hasta ahora, en el filtrado de variantes las mutaciones en heterocigosis de este gen eran descartadas en primer término sin considerar su posible efecto dominante negativo.

Os hicieron trabajar para publicar…

Los revisores pidieron más pruebas funcionales para demostrar nuestra hipótesis. Se usaron las muestras de los pacientes de las familias más accesibles y CD25 estaba bajo en todos. Sin embargo, todos proliferaron de forma similar al ser estimulados con anti-CD3ε; en rango, aunque la estimulación con PHA provocó una respuesta superior a los sujetos control. Es decir, los resultados en muestras primarias no son tan claros como en las líneas celulares. Una posible razón es que los linfocitos primarios son heterogéneos y existen mecanismos reguladores selectivos intrínsecos y extrínsecos que actúan sobre ciertas isoformas; esto complica el análisis. Expresar las proteínas mutantes en líneas celulares homogéneas ayuda a aislar y estudiar defectos que en células primarias son muy tenues.