La prueba cruzada (o crossmatch, XM) para la detección de anticuerpos específicos del donante ha sido una de las pruebas más utilizadas dentro de los laboratorios de histocompatibilidad para evaluar y clasificar el riesgo inmunológico de potenciales receptores de un trasplante alogénico. La introducción del XM por citometría de flujo (XM-CMF) ha permitido mejorar la sensibilidad en la detección de anticuerpos anti-HLA relacionados con el rechazo acelerado del injerto en comparación con el XM evaluado por citotoxicidad dependiente de complemento XM-CDC). Sin embargo, la XM-CMF presenta una serie de problemas técnicos y metodológicos que dificultan su estandarización, en donde variaciones metodológicas y del procesamiento analítico pueden influenciar los resultados. Para abordar este problema, el Grupo Español de Trabajo en Histocompatibilidad e Inmunología del Trasplante (GETHIT) empezó a trabajar en el año 2022 en identificar el estado actual de los principales aspectos técnicos y metodológicos XM-CMF, susceptibles de variabilidad entre laboratorios, detallando y clasificando los materiales, reactivos y/o equipamientos actualmente utilizados. Se elaboró una encuesta online dirigida a los laboratorios clínicos con experiencia en el XM-CMF miembros del GETHIT.

La encuesta incluyo las fases preanalítica, analítica y postanalítica de la prueba, recopilando información sobre prácticas metodológicas, uso de reactivos y criterios de validación. Participaron 17 centros con experiencia variada, desde menos de 5 años hasta más de una década, con una mediana de 30 pruebas anuales para donantes vivos y 96 para donantes fallecidos. Este esfuerzo colectivo permitió  identificar puntos críticos susceptibles de armonización y desarrollar recomendaciones orientadas a mejorar la reproducibilidad y fiabilidad del XM-CMF. Los resultados iniciales de esta encuesta fueron presentados en el 44 Congreso de la Sociedad Española de Inmunología, que tuvo lugar en Bilbao en 2023, dentro del l Taller de trabajo del GETHIT. En la tabla 1. se resumen los factores críticos identificados en la encuesta.

En el grupo de trabajo y con los resultados de la encuesta obtenidos se discutió sobre el reto que constituye la validación experimental del XM-CMF, no sólo influenciado por la variabilidad biológica inherente de las células, sino también por otros factores que van desde la estabilidad de las muestras, los requisitos de configuración del citómetro y el análisis de los datos y la interpretación de los resultados. Además, una de las mayores dificultades de la técnica también tiene que ver con la expresión variable de las moléculas HLA, así como otros factores a considerar, como el tipo de fuente de las células, el tratamiento de los sueros, los fluorocromos utilizados, el tipo de anticuerpo anti-IgG, la titulación, los volúmenes de los reactivos, los tiempos de incubación, los controles positivos y negativos, así como el tipo de análisis y los puntos de corte para considerar la prueba positiva. Por tanto, tras esta reunión, el GETHIT decidió elaborar un documento que incluya recomendaciones que favorezcan las buenas prácticas en el laboratorio para la implementación de la técnica de XM-CMF.

Para la jornada de Talleres y Grupos de Trabajo de la SEI, llevada a cabo en Valladolid en mayo de 2024, se presentó el primer borrador del documento titulado: Recomendaciones GETHIT para las buenas prácticas en la prueba cruzada por citometría de flujo. Este documento está clasificado como recomendaciones, que representan la opinión consensuada de los autores, según la evidencia disponible en el momento de su redacción, elaboradas a partir de guías y/o publicaciones relevantes disponibles sobre los aspectos técnicos y/o metodológicos del XM-CMF, y enfocados a mejorar la práctica de laboratorio para un procedimiento, método, recurso o infraestructura, diferenciándose de los estándares, los cuales son aquellos requerimientos mínimos requeridos previamente para la acreditación de un laboratorio. Por tanto, está dirigido a los laboratorios que prestan servicios clínicos de pruebas cruzadas por citometría de flujo, con el fin de servir de guía para optimizar sus resultados.

Dentro del documento las prácticas sugeridas han sido clasificadas como recomendaciones han sido identificadas precedidas de una «R”, lo que indica que la implementación de la recomendación está enfocada el mejorar las buenas prácticas de la metodología, y sugerencias que van precedidos de una «S», lo que indica que el enunciado corresponde a comentarios que aportan detalles a la recomendación. El documento también aporta un resumen de los aspectos críticos del proceso de análisis y métodos de validación requeridos para su implementación y finalmente se describen la metodología de validación y los criterios de aceptación para su validación, permitiendo un punto de partida para documentar el proceso de validación interna a la hora de implementar el XM-CMF en un laboratorio de histocompatibilidad. Tras un proceso de revisión por el GETHIT, se presenta la primera versión del documento, el cual se encuentra disponible en el siguiente enlace: www.inmunologia.org y como material suplementario de este número de la revista de Inmunología.

Cabe destacar que los laboratorios de histocompatibilidad tenemos el objetivo proporcionar procedimientos de pruebas diagnósticas in vitro de alta calidad y con resultados fiables para los clínicos de nuestros hospitales y centros asociados para el diagnóstico. Sin embargo, nos enfrentamos a una situación única, especialmente con aquellas pruebas diagnósticas para las que no existe un equivalente de diagnóstico in vitro (IVD, in vitro diagnostic) o en las que se han realizado modificaciones significativas en el ensayo de un método previamente publicado. Por tanto, este documento pretende servir de guía para facilitar el proceso de validación interna de la técnica XM-CMF al considerar métodos para evaluar las posibles variaciones que pueden existir en cada uno de los laboratorios. Adicionalmente, este documento permite un punto de partida para la elaboración de un procedimiento operativo estandarizado que permita reducir las tasas de errores de resultados del XM-CMF y que permita una mejor inter-comparación de resultados entre diferentes centros, lo que podría reflejarse a largo plazo en los resultados de programas de calidad externos del área de histocompatibilidad.